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細(xì)胞周期檢測(cè)
來(lái)源：萬(wàn)物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
細(xì)胞周期
細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等。
一、BrdU法
1、原理
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過(guò)兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。
細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小時(shí)）
2、儀器、用品與試劑
2.1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2.2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
3、操作步驟
3.1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最終濃度為10μg/ml。
3.2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3.3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
3.4、常規(guī)染色體制片（見(jiàn)第三部分：染色體技術(shù)）。
3.5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
3.6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
3.7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
3.8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)第一、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
3.9、計(jì)算：
2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉·2H2 O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。
附：BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
二、PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期
1、離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次。
2、加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過(guò)夜，或-20℃長(zhǎng)期固定（4℃過(guò)夜一般隔天就進(jìn)行檢測(cè)，如果想推遲幾天測(cè)，那就保存在-20℃，有資料說(shuō)-20℃可以保存一個(gè)月，個(gè)人建議盡量在最短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，有些實(shí)驗(yàn)是在不同時(shí)間點(diǎn)上收細(xì)胞，這時(shí)我就等最后一次固定完了一塊測(cè)，基本上也多在一周內(nèi)檢測(cè)完畢，沒(méi)有特地去比較保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響）。
3、細(xì)胞染色
離心收集細(xì)胞，以1mL的PBS洗細(xì)胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分鐘（PI我是直接用PBS配成工作濃度，然后加入細(xì)胞沉淀混勻，RNA酶現(xiàn)加，但有時(shí)不加發(fā)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也沒(méi)太大的影響） 。
4、流式分析
以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，一般計(jì)數(shù)2-3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。
分析時(shí)，使用FL2-w和FL2-A顯示，去除聯(lián)體細(xì)胞。
細(xì)胞周期流式后一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有個(gè)凋亡峰(也稱sub-G0期),而如果分析時(shí)細(xì)胞窗口沒(méi)設(shè)置好，可能在最前面還有細(xì)胞碎片峰。
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標(biāo)書(shū)基金實(shí)驗(yàn)咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實(shí)驗(yàn)結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗(yàn)證
實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)文章潤(rùn)色 動(dòng)物模型裸鼠成瘤
臨床檢測(cè)科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作