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細胞凋亡檢測
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
細胞凋亡
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關(guān)。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
一、實驗步驟：
1. 凋亡細胞的制備
2. 200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。
5. 加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。
6. 加入300 μl標記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）檢測。
二、注意事項：
1. 整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。
三、實驗結(jié)果
用熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細胞壞死中。以FITC標記的Annexin V, 可以同時結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。
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標書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實驗結(jié)題指導(dǎo) 細胞分子功能驗證
實驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作