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細(xì)胞增殖
來(lái)源：萬(wàn)物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
細(xì)胞增殖
細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。單細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體。多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì)胞，用來(lái)補(bǔ)充體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞。
多細(xì)胞生物可以由一個(gè)受精卵，經(jīng)過(guò)細(xì)胞的分裂和分化，最終發(fā)育成一個(gè)新的多細(xì)胞個(gè)體。必須強(qiáng)調(diào)指出，通過(guò)細(xì)胞分裂，可以將復(fù)制的遺傳物質(zhì)，平均地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去?？梢?jiàn)，細(xì)胞增殖是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。
一、流式熒光染色法
原理：
熒光染料CFSE， 即羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，這使得CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖時(shí)，具有熒光的胞質(zhì)蛋白被平均分配到第二代細(xì)胞中，這樣與第一代細(xì)胞相比，其熒光強(qiáng)度便會(huì)減弱至一半；以此類推，分裂得到的第三代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度便會(huì)比第二代細(xì)胞再次減弱。這種現(xiàn)象可以在488nm的激發(fā)光下，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，通過(guò)檢測(cè)到細(xì)胞熒光強(qiáng)度不斷的降低，進(jìn)一步分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。
實(shí)驗(yàn)步驟，以小鼠脾細(xì)胞為例：
1.取一只6-8周小鼠頸椎脫臼處死后，將其全部浸泡于75%酒精中；
2.在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌取出小鼠脾臟；
3.用無(wú)菌注射器內(nèi)芯研磨脾臟，盡量不殘留較大組織塊；再用3mlPBS沖洗后，將脾臟研磨液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至15mL離心管中，離心350g，5min；
4.棄上清后，加入2mL紅細(xì)胞裂解液，輕微吹打，裂解2min后加入等體積PBS終止裂解反應(yīng)，混勻后離心350g，5min；
5.棄上清，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀，并取10μL細(xì)胞液計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至2.0×106/ml；
6.提前將CFSE按照說(shuō)明書(shū)用DMSO配成5mM母液，并分裝儲(chǔ)存于-80冰箱，其工作濃度為0.5-25μM；
7、取部分細(xì)胞作為不染色組陰性對(duì)照，其他細(xì)胞加入CFSE溶液，使得終濃度為5μM，37°C避光孵育15min；
8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培養(yǎng)液，4℃，5min以中止染色；
9、棄上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培養(yǎng)液洗2次，最后用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，充分吹打成單細(xì)胞懸液，將上述細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板,每孔105個(gè)細(xì)胞（陽(yáng)性對(duì)照用PHA刺激）；
10、37℃，5%CO2培養(yǎng)3天后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞488nm激光器檢查細(xì)胞增殖情況。
結(jié)果分析：用FlowJo分析細(xì)胞增殖
在FSC/SSC 上圈出目標(biāo)細(xì)胞，使用 FSC-W/FSC-A 排除黏連體，使用 CFSE 單參看目標(biāo)細(xì)胞的增殖情況。以下圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)：細(xì)胞攝取染料后，信號(hào)最強(qiáng)，在最右邊（不分裂的話，就是那個(gè)桃紅色的峰），隨著細(xì)胞的每一次分裂，細(xì)胞內(nèi)染料的濃度被稀釋一倍，信號(hào)也減弱一半，以此類推，由于細(xì)胞的分裂不同步，所以最后的結(jié)果是紅色的那些齒狀的峰。
對(duì)照組：
實(shí)驗(yàn)組：
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：
CFSE的濃度國(guó)外報(bào)道從0.5uM-20uM都有，建議終濃度為2.5-5uM。濃度太低，細(xì)胞標(biāo)記的熒光強(qiáng)度不夠，太高了對(duì)細(xì)胞有毒性，且影響細(xì)胞增殖。標(biāo)記孵育時(shí)要經(jīng)常搖勻。
二、CCK-8法
實(shí)驗(yàn)原理：
CellCounting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。
【一站式整體科研服務(wù)，成就更高水平的科研成果】
標(biāo)書(shū)基金實(shí)驗(yàn)咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實(shí)驗(yàn)結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗(yàn)證
實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)文章潤(rùn)色 動(dòng)物模型裸鼠成瘤
臨床檢測(cè)科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作