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GST pull down
來源：萬物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
GST pull down
GST pull down（GST融合蛋白沉降技術(shù)）是體外檢測(cè)蛋白相互作用的常用方法，可驗(yàn)證已知蛋白之間的互作，也可用于篩選與已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便，簡(jiǎn)單易行。
GST pull down實(shí)驗(yàn)原理
GST pull down的主要原理是利用DNA重組技術(shù)將已知蛋白與GST融合，而融合蛋白通過GST與固化在載體上的GTH（谷胱甘肽）親和結(jié)合。簡(jiǎn)單來說，我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結(jié)合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定時(shí)間，然后洗去未結(jié)合的蛋白，煮沸beads進(jìn)行SDS-PAGE電泳。通過Western blot檢測(cè)結(jié)果，我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對(duì)應(yīng)的條帶，即表明了a蛋白和b蛋白因發(fā)生相互作用而被GST-a pull down（GST對(duì)照只顯示一個(gè)條帶）。
GST pull down實(shí)驗(yàn)步驟
GST-a融合蛋白的制備
1．GST-a融合蛋白的表達(dá)
(1)將目的蛋白與GST的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株中；
(2)挑取單克隆到含有5ml LB培養(yǎng)基（加入5ul氨芐）的10ml試管里，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；
(3)將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB（含500ul氨芐）的1L錐形瓶中，37℃，200rpm培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；
(4)測(cè)定OD600值，當(dāng)OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在20℃，200rpm條件下培養(yǎng)10-16h（通常需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間）；
(5)誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后，將菌液分次倒入50ml離心管中，4℃ 4000rpm離心10分鐘，然后棄去上清，收集管底菌體，如暫時(shí)不用，可將菌體保存于-80℃冰箱中；
(6)先加入少量PBS于離心管中，離心5-10min后棄去上清，再按每10ml菌液沉淀1ml PBS的量加入相應(yīng)的PBS，渦旋振蕩，使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中；
(7)把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進(jìn)行破碎。每次超聲破碎20s，間隔30s（破碎時(shí)間、破碎次數(shù)和間隔時(shí)間視具體情況而定），經(jīng)過適當(dāng)時(shí)間超聲后，溶液會(huì)顯得澄清；
(8)將超聲后的溶液4℃ 4000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
2．GST-a融合蛋白的純化
(1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B，4℃搖床上緩慢搖動(dòng)30~60min;
(2)4℃，4000rpm離心5min，棄去上清，該Sepharose上結(jié)合了GST-a融合蛋白；
(3)加入200ul預(yù)冷的PBS溶液，輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌一次，4℃，4000rpm離心5min，棄去上清，重復(fù)此步驟3次；
(4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體，但注意不要吸走珠子，即可獲得結(jié)合GST-a的Sepharose。
b蛋白的制備
b蛋白可融合His標(biāo)簽進(jìn)行原核表達(dá)，也可融合Flag/HA/Myc等標(biāo)簽進(jìn)行真核表達(dá)。
體外蛋白的結(jié)合
(1)將結(jié)合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中，加入20ul含有b蛋白的溶液，同時(shí)采用結(jié)合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對(duì)照，在搖床上晃動(dòng)4-8h（4℃）；
(2)4℃，4000rpm離心5min，棄去上清液；
(3)沿壁加入200ul預(yù)冷的緩沖液對(duì)Sepharose進(jìn)行洗滌，
(4)4℃，4000rpm離心5min，棄上清，該步驟重復(fù)3次；
(5)吸干Sepharose上面的液體后，加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5min，放入-20℃冰箱備用；
(6)通過SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行檢測(cè)
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