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Western Blot免疫印跡
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
Western Blot免疫印跡
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、 原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
二、WB技術(shù)操作步驟：
1 樣品準(zhǔn)備
1）分別取大約200mg組織加入液氮碾磨成粉末狀，按每200mg組織加900μl上樣Buffer(無溴酚藍(lán))和100ul 10mg/ml PMSF，混勻，玻璃勻漿器冰點勻漿；
2）4℃，12000rpm離心10min；
3）取上清夜-70℃凍存24hr；
4）4℃ 12000rpm再次離心10min，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(lán)(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min，后于-20℃保存待用。
2 定蛋白及計算電泳上樣量
根據(jù)總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為40ug
3 電泳
1）安裝好電泳裝置；
2）根據(jù)不同的指標(biāo)配制相應(yīng)濃度的分離膠，灌膠約3/5體積，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇)；
3）30min后，待凝后傾去封液；
4）配5%的濃縮膠，灌膠至距平板頂部2mm處，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去離子水清洗加樣孔，用濾紙吸干；
5）上樣：各樣品取50ug上樣，marker取10μl上樣(上樣前需按說明書進(jìn)行預(yù)處理)；
6）緩慢加入內(nèi)、外槽緩沖液，接通電源，90v電泳至指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓至150V繼續(xù)電泳；
7）當(dāng)指示劑距平板底端1cm處時停止電泳；
4 轉(zhuǎn)膜及檢測
1）準(zhǔn)備2個12cm的平面皿，一個裝去離子水浸泡NC膜20min，另一裝轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min；
2）取下膠，切除濃縮膠部分后，將分離膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中約5min；
3）按順序安裝好轉(zhuǎn)膜裝置（黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板）；
4）完全排除氣泡， 4℃，100mA轉(zhuǎn)膜2h；
5）傾去轉(zhuǎn)膜緩沖液，拆除轉(zhuǎn)膜裝置，將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min，用去離子水清洗至能看到條帶，后用鉛筆標(biāo)出marker位置，再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右；
6）將膜轉(zhuǎn)移至另一容器中，用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過夜；
7）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗；
8）37℃搖床孵育約2h；
9）PBST洗滌4次，每次5min；
10）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗，37℃搖床孵育約30min；
11）PBST洗滌4次，每次5min；
12）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室溫孵育30min；
13）取出NC膜，用蒸餾水漂洗后晾干；
14）掃描及分析。
三、 注意事項
1、 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。
2、 顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
3、 DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。
4、客戶要確保檢測樣本沒有問題。
5、客戶要確?？贵w的有效性。
6、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。
7、收費標(biāo)準(zhǔn)：以每張膜8個樣本收費，不足8個樣本的按8個樣本收費）
四、萬物生物|WB實驗周期：
接受樣本后，1-2個月。
五、萬物生物|WB實驗注意事項：
1、客戶要確保檢測樣本沒有問題。
2、客戶要確?？贵w的有效性。
3、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。
4、收費標(biāo)準(zhǔn)：以每張膜8個樣本收費，不足8個樣本的按8個樣本收費）
六、萬物生物|WB服務(wù)結(jié)果提供：
1、目的蛋白實驗圖片。
2、灰度分析結(jié)果。（免費分析）
3、內(nèi)參結(jié)果。（免費跑膠）
4、詳細(xì)的實驗步驟。
5、免費提供蛋白樣本保存液。
結(jié)果展示
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標(biāo)書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實驗結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗證
實驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作