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包埋切片
來(lái)源：萬(wàn)物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
切片法
切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經(jīng)過(guò)一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過(guò)程十分繁復(fù)。在制作過(guò)程中，還要經(jīng)過(guò)一系列的物理和化學(xué)的處理，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進(jìn)行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術(shù)復(fù)雜，但是，它最能保持細(xì)胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長(zhǎng)時(shí)間地保留細(xì)胞的原貌，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法。
石蠟制片操作程序如下：
1、材料的采集與分割
采集材料應(yīng)根據(jù)制片的目的和要求而定，材料要有代表性，無(wú)病蟲(chóng)害或其它損傷，如要觀察病理解剖，則要取病斑、病癥部位。采下的材料應(yīng)立即放在標(biāo)本箱或濕布包起來(lái)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分割固定（如有條件也可在試驗(yàn)地采集后進(jìn)行分割固定）。
為使固定液能迅速的滲透材料，材料要進(jìn)行分割。分割時(shí)動(dòng)作要迅速，以防材料萎蔫。分割塊的大小，宜小不宜大，一般不超過(guò)1cm3，分割后立即殺死固定。
2、殺死與固定
利用藥劑迅速把細(xì)胞殺死，以保持材料本來(lái)的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。常用的固定液有F.A.A固定液、卡諾固定液等。將固定液放在具塞小瓶中，投入材料，蓋好瓶蓋。用F.A.A固定液固定，時(shí)間至少24小時(shí)。
F.A.A固定液既是良好的固定劑，也是保存劑，因此材料可長(zhǎng)期保存在固定液中備用?？ㄖZ固定液穿透力強(qiáng)，固定較小材料一般1~6小時(shí)即可，最多不超過(guò)24小時(shí)。因卡諾固定液不能做保存劑，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每級(jí)約20min.，然后保存在70%的酒精中備用。
3、脫水
脫水的目的是除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進(jìn)行，因?yàn)檫@些程序中所用的藥品都不能與水混合，所以必須脫水。常用的脫水劑為酒精。脫水過(guò)程應(yīng)緩慢進(jìn)行，不能操之過(guò)急或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免組織變硬變脆或發(fā)生收縮現(xiàn)象。
脫水采用等級(jí)脫水（系列脫水），即從較低濃度酒精開(kāi)始，逐漸替換到高濃度酒精。一般為：50%→70%→80%→95%（此時(shí)可加少許番紅，使組織著色便于包埋時(shí)定位）→無(wú)水酒精（兩次），每級(jí)停留時(shí)間2~4小時(shí)或更長(zhǎng)（無(wú)水酒精中時(shí)間宜短）。
用 95%酒精配制各濃度酒精的方法：設(shè)原有酒精濃度為A，所需配制酒精濃度為B，則取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸餾水，即可獲得Aml的B%的究竟。例如：95%酒精配成70%的酒精，則取70ml的95%酒精，加上25ml蒸餾水，則配成了95ml的70%的酒精。
4、透明
透明的目的是將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增記折光系數(shù)；同時(shí)便于下步的浸蠟和包埋等程序（因?yàn)榫烤共荒苋芙馐灒?。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑。常用的透明劑為二甲苯和氯仿，適用原則也是逐級(jí)進(jìn)行，可減少材料收縮。
一般步驟是：2/3純酒精+1/3二甲苯→1/2純酒精+1/2二甲苯→1/3純酒精+2/3二甲苯→二甲苯（兩次），每級(jí)停留時(shí)間0.5~2小時(shí)或更長(zhǎng)些。二甲苯穿透能力強(qiáng)，但又宜使材料收縮變脆，使用時(shí)不能在其中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。若材料放入二甲苯中時(shí)有白色混濁現(xiàn)象發(fā)生，說(shuō)明材料脫水不徹底，應(yīng)把材料退回至純酒精中再行脫水。
5、浸蠟
浸蠟的目的是逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替。常用的包埋劑是石蠟。浸蠟過(guò)程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細(xì)胞中去，最后使透明劑完全被石蠟取代，以便切片。
一般所用的石蠟分軟蠟（熔點(diǎn)40℃ 以下）和硬蠟（熔點(diǎn)40℃以上）。浸蠟過(guò)程一般是從低溫到高溫、從低熔點(diǎn)到高熔點(diǎn)逐漸進(jìn)行，這一過(guò)程不能操之過(guò)急，否則浸蠟不徹底影響切片。此外，軟材料可用熔點(diǎn)較低石蠟，較硬的材料可用熔點(diǎn)較高的石蠟；冬季可用熔點(diǎn)較低的石蠟，夏季可用熔點(diǎn)較高的石蠟。
石蠟必須純凈，不含雜質(zhì)。整個(gè)浸蠟過(guò)程需在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行（按需要調(diào)整溫度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蠟，浸蠟過(guò)程中逐漸使二甲苯揮發(fā)，并不斷加入純石蠟，直至石蠟飽和為止。浸蠟時(shí)間大約1~2天。
6、包埋（埋蠟、沉床）
材料浸蠟后再換兩次已熔融的純蠟，然后將材料和石蠟一起倒入提前疊好的包埋紙盒中，用加熱的鑷子迅速將材料按一定的間隔和所需的切面擺放整齊，同時(shí)用加熱的鑷子趕走材料周?chē)臍馀荩埡斜砻娴氖災(zāi)毯髮⒓埡衅椒湃肜渌?，使石蠟迅速凝固。最后從紙盒中取出蠟塊，以便保存。注意將樣品編號(hào)封于蠟塊上，以免樣品混淆。
7、修塊
將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面，用單面刀片將小蠟塊切成梯形，并可粗視到材料切面。然后用燒紅的蠟鏟把蠟塊底部牢固的粘接在載蠟器上。
8、切片
用切片機(jī)（如旋轉(zhuǎn)切片機(jī)）將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶。切片時(shí)先把切片刀夾在刀架上，再把載蠟器夾在固定裝置上（注意安裝切刀的角度，刀口運(yùn)行方向與材料切面平行），然后調(diào)整好所需厚度，一般可在7~14微米，視材料和所需觀察對(duì)象而定，一般葉片、芽可厚些，胚囊和花粉?？杀⌒D(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)切片。
9、粘片
切下來(lái)的切片經(jīng)過(guò)鏡檢（根據(jù)情況也可不檢），將符合要求的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時(shí)先在載玻片上滴上一小滴粘片劑（可用蛋青和甘油各50ml，加1g 水楊酸混合而成），加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干。
10、脫蠟、染色、脫水透明和封片
粘片后要經(jīng)過(guò)脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永久保存。下面以植物生物學(xué)中觀察組織結(jié)構(gòu)最常用的番紅-固綠染色法說(shuō)明脫蠟、染色、脫水透明和封片的過(guò)程：
二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→1/3純酒精+2/3二甲苯（1~2min.）→1/2純酒精+1/2二甲苯（1~2min.）→2/3純酒精+1/3二甲苯（1~2min.）→純酒精兩次（每次1~2min.）→95%、85%、70%、50%梯度酒精復(fù)水（每級(jí)1~2min.或更長(zhǎng)）→用 1%番紅配50%酒精染色1小時(shí)→50%、70%、85%、95%梯度酒精脫水（每級(jí)1~2min.或更長(zhǎng)）→用0.1%固綠配95%酒精復(fù)染2~5秒 →95%酒精脫水1~2分鐘→純酒精兩次（每次1~2min.）→2/3純酒精+1/3二甲苯透明（1~2min.）→1/2純酒精+1/2二甲苯透明（1~2min.）→1/3純酒精+2/3二甲苯透明（1~2min.）→二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→加拿大樹(shù)膠封片→貼標(biāo)簽鏡檢及保存。
包埋
切片
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1、固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10~15倍。
2、根據(jù)組織的不同和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，選取不同的固定劑。
3、固定時(shí)間依材料大小、固定劑種類(lèi)而異，可從1小時(shí)到幾時(shí)小時(shí)，有時(shí)中間需要更新固定劑。某些固定劑對(duì)組織的硬化作用較強(qiáng)，作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過(guò)長(zhǎng)。
4、取材切面要平整，厚度不易超過(guò)2mm，否則脫水效果不能保證。
5、對(duì)于有特許要求的組織，取材時(shí)要保證對(duì)目的組織的完整保留。
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標(biāo)書(shū)基金實(shí)驗(yàn)咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實(shí)驗(yàn)結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗(yàn)證
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