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transwell遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)
來(lái)源：萬(wàn)物 發(fā)布時(shí)間：2021-08-31
細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。
遷移實(shí)驗(yàn)（cell migration assay）
實(shí)驗(yàn)步驟：
（1）所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwell chamber 放在37℃溫育；
（2）待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用PBS和無(wú)血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105 /ml；
（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養(yǎng)基，上室加入100－150μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時(shí)；
（4）用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；
（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800μl Giemsa染液的孔中，室溫染色15－30分鐘；
（6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；
（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片；
（8）顯微鏡下取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果
注意事項(xiàng)
（1）根據(jù)待測(cè)細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細(xì)胞），如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；
（2）根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間。常規(guī)24-well chamber接種細(xì)胞數(shù)約為2≈5×104/well，遷移時(shí)間12≈36小時(shí)；
（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個(gè)獨(dú)立的chamber，為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Corning）；
（4）如果細(xì)胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)獲得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)；
（5）細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；
（6）固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；
（7）Chamber和膜上都無(wú)法標(biāo)記，操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；
（8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。
細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) （cell invasion assay）
操作步驟
（1）Matrigel在4℃過(guò)夜融化；
（2）用4℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作；
（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時(shí)使其干成膠狀；
（4）后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)（1-8）。
注意事項(xiàng)
（1）Matrigel在過(guò)高或過(guò)低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷；
（2）鋪膠時(shí)保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；
（3）其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。
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標(biāo)書(shū)基金實(shí)驗(yàn)咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
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