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產(chǎn)品詳情
操作說明
注意事項
產(chǎn)品簡介
絕大多數(shù)正常細胞的分裂能力是有限的，在不能分裂后就進入衰老狀態(tài)，此過程即為細胞衰老（cell senescence），細胞衰老是細胞控制其生長潛能的保障機制，一般含義是復制型衰老（replicative senescence）。正常細胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后停止分裂，出現(xiàn)不可逆的生長停滯，此時細胞仍然是存活的，但是細胞形態(tài)和生理代謝活性發(fā)生明顯變化，通常表現(xiàn)為細胞體積變大，與衰老相關的β-半乳糖苷酶為活化狀態(tài)。β-半乳糖苷酶是細胞溶酶體內(nèi)的水解酶，通常在pH 4.0時表現(xiàn)活性，但在衰老細胞內(nèi)該酶在pH 6.0條件下表現(xiàn)活性。本試劑盒即是基于此現(xiàn)象及原理，針對衰老相關β-半乳糖苷酶活性水平上調(diào)而對衰老組織或細胞進行染色。具體反應原理就是以X-Gal為底物，衰老細胞特異性β-半乳糖苷酶催化該底物生成藍色產(chǎn)物，表現(xiàn)為細胞胞質有藍色沉積物，可以在光學顯微鏡下進行觀察。按照每個樣品染色液用量為1 mL計算，本試劑盒可完成100個樣品的染色。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸；4℃避光保存，有效期12個月。其中X-Gal粉末如果配制成溶液后分裝成小份-20℃保存，3個月內(nèi)有效。
使用方法
l 試劑準備
1. 自備PBS緩沖液。
2. 將100 mg X-Gal粉末用5 mL DMF（二甲基甲酰胺）充分溶解混勻，分裝至1.5 mL潔凈離心管中，每管0.5 mL，-20℃避光保存。避免反復凍融。
3. 按照下表比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液。如果是6孔板培養(yǎng)的細胞，每孔需要1.0-1.5 mL染色工作液，如果是12孔板，每孔需要0.5-1.0 mL染色工作液。根據(jù)樣本量配制染色液，避免浪費。
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Component |
Volume |
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β-半乳糖苷酶染色液A |
940 μL |
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β-半乳糖苷酶染色液B |
10 μL |
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X-Gal溶液 |
50 μL |
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總體積 |
1 mL |
l 染色步驟
1. 對于貼壁細胞
(1) 6孔板培養(yǎng)好的細胞（或細胞爬片），吸除細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。
(2) 棄去固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次2 min。
(3) 用移液器將PBS 吸除干凈，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液，置于37℃孵育2 h至過夜。注意：不能在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。染色期間需及時觀察顯色情況，如果樣本中β-半乳糖苷酶表達量較高，在數(shù)小時內(nèi)即可完成染色。如果β-半乳糖苷酶表達量低，則需適當延長孵育時間，期間需用保鮮膜或parafilm封住6孔板，防止液體蒸發(fā)影響染色結果。
(4) 普通光學顯微鏡下觀察，陽性細胞顯色后，去除染色工作液。如果需要復染細胞核，向孔板內(nèi)加入少量核固紅染液覆蓋細胞室溫染色3 min，去除染色液，用PBS清洗數(shù)次。
(5) 加入2 mL PBS覆蓋細胞，至此染色完成，此樣本可于4℃保存1周?；蛘呒尤?0%甘油覆蓋細胞，4℃可保存較長時間。如果是細胞爬片，則可將爬片充分烤干，二甲苯透明后滴加中性樹膠封片，可長期保存。
2. 對于冰凍切片
(1) 冰凍切片室溫復溫10 min。以組化筆畫圈，將組織圈出。
(2) 向組織上滴加適量β-半乳糖苷酶染色固定液，以完全覆蓋住組織為宜，室溫固定20 min。
(3) 組織切片經(jīng)PBS浸泡洗滌3次，每次5 min。
(4) 將切片置于避光濕盒中，向組織上滴加適量β-半乳糖苷酶染色工作液，需完全覆蓋住組織。濕盒放入37℃孵育，每隔2 h顯微鏡下觀察顯色情況，如果未見顯色，則繼續(xù)孵育，直到組織上衰老細胞顯色。如果樣本需過夜孵育，則需滴加足量的β-半乳糖苷酶染色工作液，防止染液蒸發(fā)干片。
(5) 待組織顯色后，去除染色液，切片入PBS浸洗2次，純水浸洗2次。
(6) （可選）滴加核固紅染液染色3 min，水洗3次。
(7) 切片無水乙醇脫水2次，每次5 min再經(jīng)二甲苯透明5 min，滴加中性樹膠封片。
3. 染色結果
衰老細胞胞質內(nèi)呈散在分布的藍色。
注意事項
1. X-Gal溶液需室溫完全解凍混勻后再使用。
2. β-半乳糖苷酶染色液A和B需提前恢復至室溫后再使用，配制好的染色工作液需充分混勻無沉淀方可使用。
3. 衰老細胞β-半乳糖苷酶染色反應依賴于特定的pH條件，不能在CO2培養(yǎng)箱中進行孵育顯色，否則會影響染色工作液的pH，導致染色失敗。
4. 配制染色工作液時請選擇聚丙烯（PP）或玻璃材質的耗材，不能用聚苯乙烯（PS）材質的耗材。
5. 在顯色2 h-過夜期間需多次觀察顯色情況，時間過短可能導致陰性結果；時間太長則可能導致假陽性。顯色時間與樣本本身所含的β-半乳糖苷酶量多少有密切關系。
6. 在配制染色工作液前，需檢查染色液A的pH值，如果不是6.0（可能因保存條件導致pH發(fā)生改變），需用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0再使用。
7. 組織切片的β-半乳糖苷酶染色，對于樣本的前期準備要求較高，樣本需-80℃保存，并盡快完成檢測。因為β-半乳糖苷酶非常容易失活，樣本保存不當或時間過久，都可能導致酶失活，則染色時沒有陽性。
8. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。
本產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴格的質量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進行核對檢驗。如果發(fā)現(xiàn)有質量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進行質檢，確認產(chǎn)品質量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進行驗收。 聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價格范圍之賠償。客戶在使用過程中有任何技術問題可以撥打技術售后服務電話我們隨時給予解答。
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