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產(chǎn)品描述
乳酸脫氫酶(LDH)是糖酵解途徑的末端酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中,參與催化丙酮酸和乳酸之間的可逆反應(yīng)。通常LDH在細(xì)胞胞漿內(nèi)含量豐富,正常細(xì)胞由于細(xì)胞膜的屏障保護(hù)作用,胞內(nèi)LDH不能隨意通過細(xì)胞膜。但當(dāng)細(xì)胞受到損傷或者死亡時(shí),細(xì)胞膜的屏障保護(hù)作用消失,細(xì)胞內(nèi)的LDH被釋放至培養(yǎng)液中。通過檢測(cè)細(xì)胞膜破裂釋放到培養(yǎng)液中的LDH含量,即可對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行定量分析。
乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒主要原理是利用LDH將NAD+被還原成NADH,進(jìn)一步NADH和INT(四唑鹽)在Diaphorase(硫辛酰胺脫氫酶)催化下,生成NAD+和紅色甲臜,甲臜產(chǎn)生的量和LDH的含量成線性正相關(guān),且能夠在490 nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰,因此可以通過儀器進(jìn)行定量分析。本試劑盒主要用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測(cè),同時(shí)也可用于以細(xì)胞總LDH為基礎(chǔ)的細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)。
儲(chǔ)存與運(yùn)輸
冰袋(wet ice)運(yùn)輸;-20℃保存,INT溶液需避光保存,酶溶液避免反復(fù)凍融;12個(gè)月有效。
操作步驟
1. 樣品前準(zhǔn)備:
1) LDH釋放檢測(cè)樣品準(zhǔn)備:
a. 細(xì)胞接種:將細(xì)胞以合適的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置多個(gè)分組,例如:背景空白對(duì)照孔(僅含細(xì)胞培養(yǎng)基)、樣品對(duì)照孔(未經(jīng)處理的細(xì)胞孔)、樣品最大酶活性對(duì)照孔(未處理孔,細(xì)胞裂解后測(cè)胞內(nèi)總LDH量)、處理樣品孔(實(shí)驗(yàn)組)等;
b. 細(xì)胞處理:根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),除去原有培養(yǎng)基,使用PBS緩沖液洗滌一次,根據(jù)分組換上對(duì)應(yīng)的含藥物或者不含藥物的無血清或低血清培養(yǎng)基,并孵育一定時(shí)間;
c. 樣本收集:將細(xì)胞培養(yǎng)板1000 g離心5 min,取80 μL培養(yǎng)上清液,加到新的96孔板中,隨后對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定(樣品最大酶活性對(duì)照孔的樣品準(zhǔn)備工作,請(qǐng)參考細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測(cè)樣品準(zhǔn)備步驟)。
2) 細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測(cè)樣品準(zhǔn)備:
a. 細(xì)胞接種:將細(xì)胞以合適的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置多個(gè)分組;
b. 細(xì)胞處理:根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),使用含藥物或者不含藥物的培養(yǎng)基(可含血清)孵育細(xì)胞;
c. 細(xì)胞裂解:達(dá)到預(yù)定時(shí)間后,去除原培養(yǎng)基,用PBS洗滌一遍,加入120 μL細(xì)胞裂解工作液(10×細(xì)胞裂解液使用PBS稀釋10倍),并于培養(yǎng)箱中孵育30-60 min;
d. 樣本收集:將細(xì)胞培養(yǎng)板1000 g離心5 min,取80 μL裂解上清液加到新的96孔板中,隨后進(jìn)行測(cè)定。
3) (選做)LDH標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備:
如需對(duì)LDH酶活性的進(jìn)行絕對(duì)定量,請(qǐng)自行購(gòu)買和配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品,濃度可設(shè)置為10 mU/mL、5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。以每孔80 μL,梯度加至96孔板中。
2. LDH檢測(cè):
1) 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量,參考下表配制適量的LDH檢測(cè)工作液(主要對(duì)應(yīng)96孔板檢測(cè),其他規(guī)格的孔板,可視情況進(jìn)行調(diào)整);
|
1個(gè)樣品 |
10個(gè)樣品 |
20個(gè)樣品 |
50個(gè)樣品 |
反應(yīng)底物 |
20 μL |
200 μL |
400 μL |
1 mL |
INT溶液 |
2 μL |
20 μL |
40 μL |
100 μL |
酶溶液 |
3 μL |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
反應(yīng)緩沖液 |
55 μL |
550 μL |
1.1 mL |
2.75 mL |
總體積 |
80 μL |
800 μL |
1.6 mL |
4 mL |
2) 將LDH檢測(cè)工作液,加入到待檢測(cè)樣品孔中,每孔80 μL(樣本與LDH檢測(cè)工作液體積比為1:1),輕敲混均;
3) 將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,避光孵育30 min,也可用錫箔紙包裹,室溫于水平搖床上孵育30 min;
4) 使用酶標(biāo)儀,在490 nm處測(cè)定吸光度。可使用600 nm或大于600 nm的任一波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。
3. LDH結(jié)果計(jì)算:
1) 常規(guī)LDH(釋放)細(xì)胞毒性檢測(cè):
a. 將樣品對(duì)照孔、樣品最大酶活性對(duì)照孔、處理樣品孔等OD490減去背景空白對(duì)照孔OD490,并用于后續(xù)的計(jì)算;
b. 細(xì)胞毒性或死亡率計(jì)算(%)=(處理樣品孔OD490-樣品對(duì)照孔OD490)/(樣品最大酶活性對(duì)照孔OD490-樣品對(duì)照孔OD490)×100%
2) LDH酶活性的相對(duì)定量(根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異等):
a. 測(cè)定一個(gè)已知濃度的LDH標(biāo)準(zhǔn)品OD490;
b. 待測(cè)樣品LDH活性(mU/mL)=(樣品孔OD490-背景空白對(duì)照孔OD490)/(標(biāo)準(zhǔn)品OD490-背景空白對(duì)照孔OD490)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/mL)
3) LDH酶活性的絕對(duì)定量:
a. 測(cè)定一系列LDH梯度標(biāo)準(zhǔn)品OD490,根據(jù)所得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算出趨勢(shì)公式:Y(OD490)=A×LDH活力單位(mU)+B,可通過Excel等軟件計(jì)算出趨勢(shì)線的斜率和截距;
b. 檢測(cè)體系中LDH活性(mU)=(樣品孔OD490-背景空白對(duì)照孔OD490-B)/A
樣品LDH活性(mU/mL)=檢測(cè)體系中LDH活性(mU)/檢測(cè)體積(mL)
注意事項(xiàng)
1. 細(xì)胞檢測(cè)時(shí),密度不要超過85%,細(xì)胞的狀態(tài)和密度等因素都會(huì)對(duì)細(xì)胞LDH釋放造成一定的影響,且樣品準(zhǔn)備好后,盡量當(dāng)天完成檢測(cè),不要冷凍;
2. 血清中含有乳酸脫氫酶,建議使用無血清或者低血清培養(yǎng)基;如必須使用10%血清,需設(shè)置無細(xì)胞對(duì)照組,以消除背景干擾;
3. 操作時(shí)盡量溫和,避免產(chǎn)生氣泡,以免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響;
4. 為了您的健康和安全,操作時(shí)請(qǐng)穿好實(shí)驗(yàn)服、戴好手套。
本產(chǎn)品僅供科研用途,不用于臨床診斷!
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