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Annexin V-IF647/PI Cell Apoptosis Detection Kit

價格：在線咨詢

貨號：

FKU0180

產(chǎn)品規(guī)格：

50T

品牌：

萬物

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產(chǎn)品詳情操作說明注意事項

產(chǎn)品描述

細(xì)胞凋亡是發(fā)生在胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)過程中的正常生理過程，伴隨著許多形態(tài)學(xué)特征改變，其中細(xì)胞膜的丟失是細(xì)胞凋亡早期的特征之一。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)只分布在細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS會從脂膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)外側(cè)，使其暴露于細(xì)胞外側(cè)。Annexin V（膜聯(lián)蛋白V）是一種Ca²⁺依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力，會與暴露PS的細(xì)胞特異性結(jié)合，因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的指標(biāo)之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞，但能透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并將細(xì)胞核染色。

本產(chǎn)品通過將EGFP（enhanced Green Fluorescent Protein）與Annexin V組成融合蛋白作為檢測探針，檢測細(xì)胞的早期凋亡。同時以PI區(qū)分存活的細(xì)胞與壞死、晚期凋亡細(xì)胞。Annexin V-EGFP和PI結(jié)合使用，活細(xì)胞呈現(xiàn)陰性染色（Annexin V^-/PI^-），早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)單熒光陽性（Annexin V⁺/PI^-），而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈現(xiàn)雙熒光陽性（Annexin V⁺/PI⁺）。本試劑盒適用于流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。同時由于EGFP與Annexin V是1:1融合，因此本產(chǎn)品還可對凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量檢測。

儲存與運(yùn)輸

冰袋（wet ice）運(yùn)輸；2-8℃避光保存，12個月有效。

操作步驟

1. 懸浮細(xì)胞：取細(xì)胞懸液，經(jīng)500 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞；

貼壁細(xì)胞：先收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。然后用不含EDTA的胰酶消化后，與細(xì)胞培養(yǎng)上清液合并，經(jīng)500 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時間不宜過長，以免過度消化引起假陽性。

2. 用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，每次500 g、4℃離心5 min收集細(xì)胞；

3. 用預(yù)冷的1×Binding Buffer輕柔重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1~5×10⁶/mL；

4. 取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-EGFP和5 μL PI，輕柔混勻，室溫避光8-10 min；

5. 加入400 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer，輕輕搖勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。

結(jié)果分析

1. 流式細(xì)胞儀檢測

a. 流式細(xì)胞儀檢測分析時選擇合適的電壓并調(diào)好光補(bǔ)償，除實驗組外建議設(shè)置陰性對照（不加Annexin V-EGFP和PI標(biāo)記）用于調(diào)節(jié)電壓，單標(biāo)對照（只加Annexin V-EGFP，以及只加PI的細(xì)胞）用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

b. 流式細(xì)胞儀檢測分析參考實例：

用5 μM Camptothecin誘導(dǎo)Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞6 h，參照以上實驗步驟，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果如下圖所示。

EGFP最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為507 nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。經(jīng)流式細(xì)胞儀相關(guān)分析軟件繪制雙色散點圖，EGFP位于橫坐標(biāo)，PI位于縱坐標(biāo)。在典型實驗中，活細(xì)胞無熒光，散點位于左下第一象限。處于早期凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，散點位于右下第二象限。晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色、綠色雙重?zé)晒?，散點位于右上第三象限。

2. 熒光顯微鏡檢測

在載玻片上加5-10 μL經(jīng)Annexin V-EGFP和PI雙染的細(xì)胞懸液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片進(jìn)行觀察，Annexin V-EGFP呈綠色熒光信號，PI呈紅色熒光信號。

注意事項

1. 整個實驗過程操作應(yīng)盡量輕柔避免細(xì)胞破碎，影響實驗結(jié)果。

2. 用PBS清洗細(xì)胞不可省略，同時也要盡可能的去掉殘留的PBS。

3. 使用胰酶消化細(xì)胞時，應(yīng)小心操作，避免人為損傷細(xì)胞，并控制消化時間。消化時間過短，細(xì)胞需用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的機(jī)械損傷；若消化時間過長，細(xì)胞膜同樣容易受到損傷。影響檢測結(jié)果。另外不能使用含EDTA的胰酶，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。

4. 貼壁細(xì)胞經(jīng)凋亡刺激后，如有部分細(xì)胞漂浮，需同時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液及貼壁細(xì)胞合并染色，會使得結(jié)果更加準(zhǔn)確。

5. Annexin V-EGFP和PI對光敏感，操作時注意避光。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)盡快進(jìn)行檢測。

6. 實驗過程中請穿實驗服并戴一次性手套，避免污染，確保安全。

本產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！

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