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產(chǎn)品詳情
操作說明
注意事項
細胞描述
小鼠胚胎干細胞。該細胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性。當在飼養(yǎng)層（胚胎成纖維細胞或 STO 細胞）上培養(yǎng)時，細胞保持未分化狀態(tài)。在沒有飼養(yǎng)層的情況下，細胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。當注入胚泡中時，細胞可以進入生殖系。在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后，它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎。培養(yǎng)時需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞。
細胞特性
1） 來源：小鼠，129/Ola品系，胚胎內(nèi)細胞團
2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長
3） 含量：>1x106 細胞數(shù)
4） 規(guī)格：1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用
運輸和保存
干冰運輸：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 81%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 1%
P/S青霉素-鏈霉素 1%
β-巰基乙醇 0.5 mL（1000X)
LIF 5μg（10ng/mL）
使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：完全培養(yǎng)液 60%%，F(xiàn)BS 30%%，DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。
我?guī)靸龃鏁r，體積為 500 μl，預期存活率 70%，每支凍存管的細胞復蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。
二：細胞處理：
MEF 細胞鋪制：
1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養(yǎng)液。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完全培養(yǎng)液。
3. 按實驗需要：小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復蘇 MEF 細胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完全培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養(yǎng)液 1 ml，重懸后按照一個 T25 培養(yǎng)瓶鋪 1′106 的 MEF 細胞，平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞。
5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前，將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完全培養(yǎng)液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液待用。
復蘇：
1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液。
傳代：
1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。
傳代比例：1:4-1:7
凍存：
1.按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預冷的凍存液，懸浮細胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%
附：小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：
1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞，在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。
3. 1 小時后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進行后續(xù)實驗。
凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進行核對檢驗。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進行質(zhì)檢，確認產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進行驗收。 聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價格范圍之賠償。客戶在使用過程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務電話我們隨時給予解答。
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